Исследование ноотропной и нейропротективной активности Тиоцетама в условиях моделирования фетоплацентарной недостаточности

И.Ф. БЕЛЕНИЧЕВ, С.В. ПАВЛОВ, А.В. АБРАМОВ, Н.В. БУХТИЯРОВА, С.В. ГОРБАЧЕВА, Д.А. ЗУЕВА, Запорожский государственный медицинский университет

Актуальность

Проблема осложнений фетоплацентарной недостаточности (ФПН) с учетом ее определяющего влияния на развитие плода, новорожденного и детей более старшего возраста продолжает оставаться одной из важных для педиатрии [1, 8, 9, 13, 18, 42, 43, 46]. Известно, что в странах СНГ ежегодно более 500 тыс. беременных не вынашивают ребенка до срока, а мероприятия по медикаментозному сохранению беременности во многих случаях не дают желаемого результата, что весьма негативно сказывается на здоровье плода и новорожденного (хроническая внутриутробная гипоксия, недоношенность, гипотрофия, перинатальная смертность, двигательные нарушения, поражения ЦНС, отставание в развитии). Распространенность одного из наиболее манифестных проявлений ФПН, каковым является гестоз, стабильно занимающий 2-3-е место в структуре заболеваемости и смертности матери и плода, не имеет тенденции к снижению. Установлено, что длительно существующая при ФПН дисфункция плаценты приводит к нарушению нормального функционирования системы «мать - плацента - плод» со значительными изменениями основных видов обмена веществ между матерью и плодом [7, 17, 20, 24, 31, 39- 41]. В организме плода на фоне неизбежных явлений гипоксии и других нейроиммуноэндокринных нарушений наблюдаются дистрофические явления, отставание в росте и развитии, возникают серьезные расстройства мозгового кровообращения, приводящие к стойким нарушениям энергетического метаболизма нервной ткани, глутаматной эксайтотоксичности, оксидативному стрессу, апоптозу и гибели нейронов. В последующем у детей обнаруживаются снижение интеллекта, отставание в психомоторном развитии, симптомы вегетососудистой дистонии с дыхательными нарушениями и другие патологические нарушения здоровья [32, 36, 43]. Новорожденные от матерей с ФПН отличаются различными клинико-метаболическими, иммунологическими, гормональными расстройствами адаптации к внеутробной жизни, высокой частотой инфекционных заболеваний, психоневрологических нарушений и существенных отклонений развития в последующие годы жизни. Важность проблемы ФПН обусловлена тем, что вызываемые фетоплацентарной патологией тяжелые последствия для здоровья, особенно ЦНС, потомства этих матерей не удается предотвратить в должном объеме средствами, имеющимися в арсенале современной педиатрии. В настоящее время в лечении ФПН используют препараты, способствующие расслаблению мускулатуры матки (адреномиметики, спазмолитики); препараты, улучшающие микроциркуляцию и реологические свойства крови (антиагреганты, ангиопротекторы, антикоагулянты); препараты, корригирующие обменные процессы (смеси аминокислот); гепатопротекторы, антиоксиданты [4, 8, 9, 11, 18, 19, 45, 47]. В последнее время особый интерес в лечении ФПН и ее последствий представляют препараты с выраженным ноотропным и нейропротективным действием. Впервые с этой целью стали применять пирацетам (2 г пирацетама в 200 мл 5% раствора глюкозы, внутривенная инфузия в течение 30 минут). Пирацетам играет особую роль, влияя на обменные процессы и кровообращение мозга плода. Препарат стимулирует окислительно-восстановительные реакции, усиливает утилизацию глюкозы, улучшает регионарный кровоток в ишемизированных участках мозга. Пирацетам повышает энергетический потенциал организма за счет ускорения оборота АТФ. Улучшение энергетических процессов под его влиянием повышает устойчивость к гипоксии. Антигипоксическая активность - наиболее важное проявление действия пирацетама. Лечебные его свойства определяются способностью восстанавливать и стабилизировать нарушенные функции мозга [1, 3, 5, 7, 10, 14, 15, 46].

Также с этой целью начали применять препараты янтарной кислоты - лимонтар и цитофлавин. Лимонтар содержит лимонную и янтарную кислоты в такой комбинации, которая позволяет устранять явления гипоксии за счет повышения образования эндогенной янтарной кислоты, нормализации окисления субстратов, усиления транспорта электронов в дыхательной цепи и процессов образования АТФ. Прием лимонтара во время беременности по 10 таблеток в каждом триместре (12-14 нед., 23-24 нед. и 35-36 нед.) позволяет снизить риск ФПН и гипоксии плода. Также был рекомендован прием цитофлавина, содержащего янтарную кислоту, пирацетам, рибофлавин, рибоксин и никотинамид в соотношении, обеспечивающем метаболитотропное, энерготропное, антиоксидантное и нейропротективное действие за счет стимуляции энергопродуцирующих реакций цикла Кребса, компенсаторных шунтов образования макроэргов, уменьшения «утечки» электронов [12]. Применение цитофлавина в дозе 0,15 мл/кг на 5% растворе глюкозы в течение 7-10 дней позволяет снизить последствия ФПН, уменьшает развитие перинатального поражения головного мозга [12, 13]. Также в лечении ФПН применяется и энерготропный препарат милдронат по 5,0 мл 10% раствора в 200 мл раствора Рингера в течение 7-14 дней внутривенно. Применение милдроната позволяет улучшить энергетический обмен плода, о чем свидетельствовало повышение уровня АТФ в крови пуповины [29]. Определенный успех в лечении ФПН и ее последствий внесло применение антиоксидантов нейропротекторов - мексидола и тиотриазолина. Мексидол повышает активность СОД, уменьшает образование маркерных продуктов окислительной модификации белков и фосфолипидов, сохраняет физико-химические константы фосфолипидного бислоя мембраны [10]. Мексидол в дозе 100 мг увеличивал содержание АТФ в эритроцитах крови пуповины и более быстро по сравнению с плацебо-группой восстанавливал двигательные функции детей, рожденных матерями с ФПН [10, 22, 31]. Тиотриазолин уменьшает образование АФК в митохондриях, участвует в сохранении окислительной продукции энергии, а также в ксантиноксидазной реакции. Тиотриазолин, снижая гиперпродукцию супероксидрадикала и пероксинитрита, предупреждает окислительную модификацию белковых структур рецепторов, ионных каналов, ферментов, факторов транскрипции. Тиотриазолин конкурирует с сульфгидрильными группами цистеиновых и метиониновых фрагментов белковых молекул за супероксидрадикал, в результате чего предотвращает как обратимую, так и необратимую их модификацию. В результате ингибирования обратимой модификации предотвращается обра зование -S-S-связи в цистеиновых участках Na+/К+-АТФазы, уменьшается потеря чувствительности фермента к регулирующему действию АТФ. Более значимое по эффективности действие тиотриазолина реализуется в отношении необратимой модификации сульфгидрильных групп ряда белковых молекул под действием АФК. Оказывая тормозящее воздействие на необратимую окислительную модификацию сульфгидрильных групп цистеиновых фрагментов белковых молекул, тиотриазолин нормализует сдвиги редокс-регуляции в условиях оксидативного стресса. Кроме того, тиотриазолин может участвовать в восстановлении этих групп при обратимой инактивации, принимая на себя роль Redox Faktor-1. Тормозя окислительную инактивацию фактора транскрипции NF-kappa В при избытке АФК, тиотриазолин, возможно, усиливает активацию экспрессии редокс-чувствительных генов, которые необходимы для защиты клеток от токсических эффектов оксидативного стресса. Среди этих генов есть гены, ответственные за синтез супероксиддисмутазы. В последнее время было установлено, что тиотриазолин обладает антиапоптозным действием [17]. Свойства препарата позволяют применять его в акушерстве для лечения некоторых патологических состояний. Под руководством В.Д. Лукьянчука на базе Луганского государственного медицинского университета было проведено исследование на тему «Фармакотерапия нарушений функций фетоплацентарного комплекса при угрозе прерывания беременности у первородящих зрелого возраста при помощи тиотриазолина и магне-В6», в результате которого было доказано, что использование тиотриазолина с магне-В6 у первородящих старше 30 лет с угрозой прерывания беременности обеспечивает существенное уменьшение частоты осложнений беременности (возникновение повторных угроз, гестозов первой и второй половины беременности) и родов (несвоевременное излитие околоплодной жидкости, экстренное родоразрешение), улучшает состояние (по шкале Апгар) и адаптацию новорожденных (чрезмерная потеря массы тела, своевременное восстановление массы тела). В 2003 году создан комбинированный препарат ноотропного, нейропротективного, антиоксидантного, противоишемического и антиапоптического действия - Тиоцетам. Тиоцетам содержит тиотриазолин и пирацетам во взаимопотенцирующих соотношениях. Тиоцетам с успехом применяется в неврологии, психиатрии, интенсивной терапии. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы стало изучение ноотропного и нейропротективного действия Тиоцетама в условиях экспериментальной ФПН.

Материалы и методы исследования

Все исследования выполнены на беременных крысах линии Вистар массой 180-200 г. При уходе за животными, питании и проведении экспериментов руководствовались базисными нормативными документами: рекомендациями комитета по биоэтике МЗ Украины по экспериментальной работе с использованием животных, рекомендациями ВОЗ, рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей. В работе использовали две модели ФПН. Первую моделировали по методике В.Е. Радзинского [21]. С этой целью с 10-11-го дня беременности в течение 7 дней вводили подкожно 50% масляный раствор четыреххлористого углерода в дозе 0,1 мл/кг. Срок беременности определяли считая со дня обнаружения спермиев в вагинальном мазке. В каждой экспериментальной группе было по 7 беременных самок. Тиоцетам вводили внутрибрюшинно в дозе 250 мг/кг за 2 часа до и через 2 часа после инъекции четыреххлористого углерода в течение 7 дней. Пирацетам вводили по такой же схеме внутрибрюшинно в дозе 500 мг/кг [17]. На 17-18-й день беременности крыс выводили из эксперимента под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг) после голодания в течение 14-16 часов. Для исследования забирались плоды (подсчитывалось количество мертвых плодов, масса тела живых), матка и плацента. Кусочки плацент крыс фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и после обычной проводки заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином, для обнаружения гликогена и гликопротеидов проводили ШИК-реакцию, белки плазмы выявляли при окраске срезов методом Пикро - Маллори II. Из другой части плацент и матки готовили гомогенаты на 100 мМ трис-HCL буфере (рН 7,4), охлажденном до +5° С, в соотношении 1 : 3. В гомогенате определялись маркеры окислительной модификации белка (ОМБ), активность СОД, позволяющие оценить активность антиоксидантной системы и интенсивность оксидативного стресса, активность NO-синтазы (NOS), содержание нитротирозина, аргинина, метионина, цистеина, уровень суммарных SH-групп и активность глутатионредуктазы, позволяющие судить о продукции, метаболизме и транспорте NO, активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и гликогена для оценки процессов биоэнергетики [30]. Вторую модель ФПН воспроизводили путем окклюзии преплацентарных сосудистых областей [41]. Для эксперимента были отобраны половозрелые самки крыс линии Вистар массой 120-170 г с 21-22-дневным циклом гестации, полученные из питомника Института фармакологии и токсикологии АМН Украины. После совокупления через 6-8 часов осуществляли цитологическое исследование содержимого влагалища, беременных крыс изолировали. На 15-16-й день (период завершения плацентации и полного перехода на плацентарное кровообращение) животным делали частичную перевязку (около 50 %) преплацентарных сосудистых областей непосредственно плодовместилища каждого плода одного из рогов матки (подопытный рог), на другом роге подобная процедура не проводилась (интактный рог). Животных фиксировали к станку в положении на спине и под эфирным наркозом в асептических условиях вскрывали брюшную полость по средней линии. В операционную рану осторожно извлекались оба рога матки с плодами. Подсчитывалось число плодов в обоих рогах, осматривались плоды через стенку матки, фиксировалось состояние и степень их развития (наличие кровообращения в области плодовместилища, маленькие размеры плода). После подсчета и ревизии плодов производили частичную перевязку преплацентарных сосудистых ветвей (около 50 %) непосредственно у плодовместилища каждого плода одного из рогов матки. После перевязки сосудов рога матки с плодами последовательно погружали в брюшную полость и рану ушивали. Продолжительность операции составляла 5-6 мин. Сразу же после операции животных отвязывали от станка и помещали в отдельную клетку, где они вели обычный образ жизни. Имели полный доступ к пище и воде. Тиоцетам вводился внутрибрюшинно сразу после выхода из наркоза 1 раз в сутки в дозе 250 мг/кг в течение 7 дней до момента наступления родов. Пирацетам вводился по той же схеме в дозе 500 мг/кг. После протекания физиологических родов на 21-22-й день часть новорожденных выводилась из эксперимента - под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг) у них извлекался головной мозг для морфологических, гистоиммунохимических и биохимических исследований. Другая часть новорожденных наблюдалась в течение 30 суток в условиях обычного образа жизни этого вида животных. Изучалось влияние препаратов на развитие основных показателей функционального роста и развития крысят: покрытие шерстью, прорезывание зубов, открытие глаз. Показатели психофизиологического развития крысят исследовали на 21-й и 30-й день жизни. Неврологический дефицит у животных определяли по шкале stroke-index C.P. McGrow [39]. Регистрировали показатели ориентировочно-исследовательских инстинктов в условиях «открытого поля». Для этого животное помещают в угол камеры и наблюдают за ее поведением в течение 3 минут. Большая прямоугольная камера (100 ´ 100 см) с пластмассовыми стенками высотой 40 см. Полом служит лист бежевого пластика, на который черной краской нанесена решетка, делящая поле на 25 (5 ´ 5) равных квадратов. Как только животное наступает на новый квадрат обеими передними лапами, это регистрируется как горизонтальное движение. У животных в течение 3 минут регистрировали горизонтальную (число пересеченных квадратов), вертикальную (число «стоек») и исследовательскую активность (число заглядываний в «норки»).

Также влияние препаратов на ВНД исследовали на модели однократного обучения - условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [9] без применения амнезирующего фактора. Способность животного к запоминанию нанесенного электроболевого раздражения рассчитывали по разнице латентного времени до и после обучения (через 24 часа). Для морфологических исследований после завершения эксперимента наркотизированных животных декапитировали, извлекали мозг, 24 часа фиксировали его в фиксаторе Карнуа [23] и далее по стандартной схеме заливали в парафиновые блоки, из которых готовили серийные фронтальные 5-микронные гистологические срезы в области СА1 зоны гиппокампа. Для этого гистологические срезы депарафинировали по стандартной методике и окрашивали галоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону для специфического выявления РНК. Изображение коры мозга получали на микроскопе Axioskop (Zeiss, Германия) и с помощью 8-битной CCD-камеры COHU-4922 (COHU Inc., США) вводили в компьютерную систему анализа изображений VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Германия). Морфометрический анализ клеток мозга осуществляли в автоматическом режиме с помощью макропрограммы, разработанной в специализированной среде программирования VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Германия).

Определяли следующие показатели:

  • плотность нейронов, глиальных клеток, апоптотических и деструктивно измененных нейронов (количество клеток на 1 мм2 площади среза коры мозга);
  • клеточный состав в области IV-V слоев коры в процентах;
  • площадь тел нейронов, глиальных клеток, апоптотических и деструктивно измененных нейронов (мкм2);
  • концентрацию РНК в нейронах, глиальных клетках, апоптотических и деструктивно измененных нейронах (единицы оптической плотности - Е ОП , которые рассчитывали как логарифм отношения оптической плотности тела клетки к оптической плотности межклеточного вещества);
  • индекс отношения количества выживших нейронов к числу апоптотических и деструктивно измененных нейронов. Для проведения гистоиммунохимических исследований головной мозг животных помещали на сутки в фиксатор Буэна (24 часа) и после стандартной гистологической проводки ткань заключали в парафин. На ротационном микротоме изготавливались 14-микронные срезы гипоталамуса, которые депарафинировались по стандартной методике. Для выявления экспрессии c-fos и Всl-2-белка в коре и гиппокампе использовали иммуногистохимический [44] метод непрямой иммунофлюоресценции. Сперва на срезы наносили первичные антитела к белку c-fos и Всl-2 (Sigma Chemical, США) и инкубировали при +4 °С 24 часа. После инкубации срезы трижды промывали 0,1 М фосфатным буфером. Затем на образцы наносили вторичные антитела (флюоресцент конъюгированный козий IgG) (Sigma Chemical, США) и инкубировали при комнатной температуре 60 мин. После инкубации срезы промывали 0,1 М фосфатным буфером. На флюоресцентном микроскопе Axioskop (Ziess, Германия) исследовали Fos-иммунопозитивные нейроны и Всl-2-иммунопозитивные нейроны, это осуществляли при помощи видеокамеры COHU-4922 (США) и вводили в систему цифрового анализа изображения VIDAS-386 (Kontron Elektronic, Германия). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета статистических программ Statistica 4.0 (Statistica Inc., США). Достоверность отличия в группах определяли t-статистикой Стьюдента.

Ткани мозга гомогенизировались на холоде в солевой изотонической среде (0,15 М КСl) при температуре +4 о С с помощью стеклянного гомогенизатора (соотношение ткани и солевого раствора 1 : 40). После чего методом дифференциального центрифугирования выделялись цитозольная фракция и митохондрии. Безбелковый экстракт получали добавлением точной навески гомогената ткани мозга в хлорную кислоту (0,6 М) с последующей нейтрализацией 5,0 М калия карбонатом [30].

Для оценки интенсивности СРО в тканях головного мозга определяли маркеры окислительной модификации белка - альдегидфенилгидразоны (АФГ) и карбоксифенилгидразоны (КФГ). Состояние энергетического обмена (гликолиз, окисление в цикле Кребса, митохондриальная активность, ГАМК-шунт) определяли по уровню наиболее значимых интермедиатов - АТФ, АДФ, АМФ, лактата, пирувата, малата по активности митохондриальной креатинфосфокиназы (м‑КФК) и малатдегидрогеназы (МДГ), сукцинатдегидрогеназы (СДГ), глутаматдекарбоксилазы, ГАМК-трансферазы, содержанию глутамата и ГАМК.

О продукции и метаболизме NO судили по активности NO-синтазы, содержанию нитратов. Определение активности СОД проводили по методике, описанной Чевари и соавт., с применением феназинметансульфата и нитросинего тетразолия [6]. Активность глутатионпероксидазы определяли с помощью теста с гидроперекисью трет-бутила [6]. Активность каталазы определяли по убыли перекиси водорода [6].

Стабильные метаболиты NO определяли по уровню нитратов в реакции Грисса [38], активность NOS - по разности между скоростью окисления NADPH, регистрируемой флюорометрически в двух параллельных образцах - как в не содержащем, так и содержащем ингибитор NOS - N-нитро-L-аргинин [12, 38].

Показатели окислительной модификации белка в тканях головного мозга определяли методом B. Halliwell [38, 40] по взаимодействию окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) и образованию альдегидфенилгидразонов и карбоксилфенилгидразона, имеющих спектр поглощения при 274 нм и 363 нм соответственно. Количество малата определяли методом Хохорста по убыли НАДН при 340 нм [30]. Содержание изоцитрата определяли методом Цоха - Ломпрехта по убыли НАДН при 340 нм [30]. Содержание пирувата определяли методом Цоха - Ломпрехта по убыли НАДН при 340 нм [30]. Содержание лактата определяли методом Хохорста по повышению НАДН при 340 нм [30]. Активность СДГ, МДГ, ГАМК-трансферазы и глутаматдекарбоксилазы определяли спектрофотометрически [30]. Адениловые нуклеотиды, ГАМК, глутамат определяли методом тонкослойной хроматографии [30]. Концентрацию аргинина, аспартата, метионина, цистеина и глутамата - методом тонкослойной хроматографии с последующей спектрофотометрией элюата [30]. Содержание суммарных SH-групп определяли спектрофотометрически по реакции с 5,5-дитиобис-7-нитробензойной кислотой [40]. Концентрацию белка оценивали методом Бредфорда. Нитротирозин определяли в гомогенате сердца твердофазным иммуносорбентным методом с помощью набора фирмы ELISA и выражали в нм/г ткани.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета статистических программ Statistica 4.0 (Statistica Inc., США). Достоверность отличия в группах определяли t-статистикой Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Масса выживших плодов из группы нелеченых животных с ФПН, вызванной введением ССL 4 (контроль) на 17-18-е сутки беременности значительно отставала от массы плодов здоровых крыс (интактная группа). Отставшие в развитии плоды отличались от интактных и некоторыми другими внешними признаками. У них отмечалась вялость в движении после извлечения из матки и освобождения от оболочек, кожа их была морщинистой и более прозрачной. Плоды от матерей с ФПН, которым назначали Тиоцетам, были более подвижными, розовыми, масса их тела была достоверно больше, чем в группе контроля. Назначение Тиоцетама приводило к достоверному снижению пренатальной смертности. Так, в группе животных с ФПН, которым назначался Тиоцетам, количество живых плодов на 1 самку составило 6,85, а в группе нелеченых животных этот показатель составлял 4,28. Назначение пирацетама животным с ФПН оказывало менее выраженное действие.

Микроскопическое исследование плацент на 17-е сутки беременности на фоне введения четыреххлористого углерода выявило признаки вторичной фетоплацентарной недостаточности. Так, в материнской части плаценты выявлено расширение кровяных лакун. В просвете лакун в изобилии выявляются гликогеновые клетки. Назначение Тиоцетама приводило к значительному уменьшению этих клеток (единицы в поле зрения). В группе крыс, принимавших Тиоцетам, наблюдается умеренное расширение лакун спонгиотрофобласта, часть из которых содержит форменные элементы крови. Назначение пирацетама не оказывало выраженного фетопротективного действия.

В плодной части плаценты также выявлены признаки вторичной фетоплацентарной недостаточности (явления нарушения гемодинамики и метаболизма). Так, наблюдается резко выраженное полнокровие материнских сосудов с явлениями эритроцитарного стаза, сланжирования и агрегации эритроцитов, развитием диапедезных и мелкоочаговых кровоизлияний. Плодные сосуды спавшие, содержат единицы форменных элементов, часто они пустые. В результате площадь материнских сосудов увеличивается, а плодных - уменьшается. В плацентах животных, получавших Тиоцетам, плодные сосуды более расширены и полнокровны, а в материнских менее выражены явления эритроцитарного стаза, что свидетельствует об уменьшении нарушений плацентарной гемодинамики. Применение пирацетама не приводило к достоверному улучшению морфологической картины.

Кроме того, в плацентах животных с фетоплацентарной недостаточностью обнаруживается утолщение базальных мембран в результате отложения в них гликопротеидов. В цитоплазме клеток цитотрофобласта наблюдается резкое снижение гликогена вплоть до полного его исчезновения. Назначение Тиоцетама приводило к увеличению содержания гликогена в цитоплазме, что свидетельствовало об улучшении энергетического обмена в плаценте. Базальные мембраны плодных и материнских сосудов более четко контурированы. Назначение пирацетама не приводило к позитивному изменению морфологической картины.

Таким образом, морфологическое исследование плацент животных с экспериментальной вторичной фетоплацентарной недостаточностью без лечения и на фоне применения Тиоцетама и пирацетама выявили у Тиоцетама наличие определенных фетопротективных свойств. Назначение Тиоцетама приводило к уменьшению нарушений плацентарной гемодинамики (влияние на кровенаполнение плодных сосудов) и, особенно, к снижению нарушений энергетического обмена (содержание гликогена).

Биохимические исследования плаценты крыс с ФПН на 17-е сутки беременности полностью подтвердили выводы морфологических исследований. Так, в плаценте животных с ФПН наблюдалось угнетение энергетического обмена, что выражалось в резком снижении содержания гликогена и торможении активности ключевого фермента окислительной продукции энергии СДГ. Подобные изменения свидетельствуют о субстратно-метаболической депривации, дискоординации в цикле Кребса и, как следствие, развитии энергетического дефицита. Кроме этого, было обнаружено увеличение содержания в плаценте маркерных продуктов окислительной модификации белка - альдегидных (АФГ) и карбоксильных продуктов (КФГ) на фоне выраженной антиоксидантной недостаточности (снижение активности СОД). Активация ОМБ на фоне угнетения антиоксидантных систем защиты клетки и накопление реакционно-способных цитотоксических продуктов приводит к угнетению активности ряда ферментов, регулирующих тонкие звенья энергетического метаболизма, химической модификации распознающих сайтов рецепторов, особенно эстрогеновых и окситоциновых, и их десенситации, изменению селективности ионных каналов. Назначение Тиоцетама значительно улучшало регистрируемые показатели энергетического метаболизма плаценты - увеличивало содержание гликогена и повышало активность СДГ. Подобное действие Тиоцетама полностью согласуется с нашими предыдущими исследованиями, которыми показана высокая энерготропная активность как Тиоцетама, так и входящего в его состав тиотриазолина в условиях ишемии миокарда и головного мозга. Введение Тиоцетама вызывало ограничение деструктивного действия оксидативного стресса, что выражалось в снижении маркеров ОМБ - АФГ и КФГ и повышении активности СОД. Именно энерготропное и антиоксидантное действие Тиоцетама, на наш взгляд, и снижает явления фетоплацентарной недостаточности, уменьшает нарушения в системе «мать - плацента - плод» и обеспечивает более здоровое развитие плода и новорожденных.

В матке животных с ФПН на 17-е сутки беременности регистрировалось угнетение процессов синтеза оксида азота, о чем свидетельствовало уменьшение активности NO-синтазы на фоне выраженного дефицита субстрата синтеза - L-аргинина. Параллельно регистрировалось и нарушение транспорта оксида азота - снижение уровня тиосодержащих аминокислот и суммарного количества восстановленных тиольных соединений. Дефицит тиолов наблюдался на фоне резкого снижения активности глутатионредуктазы - фермента, регулирующего тиодисульфидное равновесие. Общеизвестно, что NO является нестабильным, короткоживущим радикалом и для его стабилизации и последующей транспортировки предусмотрены такие механизмы, как образование с тиосодержащими низкомолекулярными соединениями (глутатион, цистеин, метионин) устойчивых тионитрозольных комплексов. В условиях дефицита тиольных соединений (оксидативный стресс, нитрозирующий стресс, ишемия, интоксикации, гипоксия, инфекция и т.д.) нарушается транспорт NO, т.к. он подвергается атаке таких АФК, как супероксидрадикал и гидроксилрадикал, с превращением в цитотоксический продукт - пероксинитрит. При моделировании ФПН наблюдается усиление продукции «паразитарной» формы NO - пероксинитрита, о чем свидетельствовало повышение в матке маркерного продукта - нитротирозина. Развитие оксидативного стресса в матке при ФПН подтверждалось увеличением продуктов ОМБ - АФГ и КФГ. Таким образом, в матке крыс с ФПН наблюдается развитие эндотелиальной дисфункции за счет угнетения метаболизма оксида азота и снижения его биодоступности. В последние годы большинство исследователей в патогенезе ФПН основную роль отводят дисфункции эндотелия, вследствие которой происходят снижение синтеза вазодилататоров и гиперпродукция вазопрессоров. Все это запускает сложную цепь патологических реакций, таких как экспрессия фактора активации тромбоцитов, тромбоксана А2 вазоконстрикторных эйкозаноидов, гиперпродукция АФК и пероксинитрита, способствующих десенситации β-адренорецепторов, окситоциновых рецепторов, активация проапоптических факторов. Следствием этих реакций является генерализованный спазм мелких сосудов в организме беременной, нарушение проницаемости капилляров, выход жидкости и белков в ткани, снижение онкотического давления и объема циркулирующей плазмы, усиление гипоксических явлений, энергодефицита. Клиническими симптомами этих процессов являются отеки, протеинурия. В последнее время прогностическое значение в протекании беременности при ФПН получили стабильные метаболиты оксида азота и уровень восстановленных тиолов. Назначение Тиоцетама не оказывало влияния на синтез оксида азота в матке (активность NO-синтазы и L-аргинина достоверно не изменялась). Но у Тиоцетама (за счет входящего в его состав антиоксиданта тиотриазолина) обнаружено уникальное свойство оказывать защитное действие в отношении транспорта NO и тем самым повышать его биодоступность за счет сохранения достаточного количества для защиты и транспорта NO-тиосодержащих молекул. Введение крысам с ФПН Тиоцетама приводило к достоверному увеличению в матке уровня общих восстановленных тиолов, цистеина, метионина и повышению активности глутатионредуктазы. Тиоцетам способен как непосредственно восстанавливать тиольные группы (свойства тиотриазолина), так и уменьшать их окисление в результате оксидативного стресса. Так, нами было обнаружено, что введение Тиоцетама приводило к достоверному снижению продуктов ОМБ - АФГ и КФГ в матке крыс с ФПН. Тиоцетам способен повышать биодоступность NO за счет образования тиотриазолина из NO-стабильных транспортабельных тионитрозильных комплексов. Тем самым предотвращается превращение NO под действием АФК в пероксинитрит, сохраняются его эндотелиопротективные свойства (о чем свидетельствовало достоверное снижение нитротирозина в матке крыс с ФПН). Пирацетам не оказывал подобного действия.

Проведенные нами биохимические исследования мозга новорожденных крысят от матерей с ФПН, вызванной окклюзией 50 % преплацентарных сосудистых ветвей непосредственно у плодовместилища каждого плода одного из рогов матки, выявили стойкие нарушения энергетического обмена. Нами впервые было установлено, что протекание беременности в условиях ФПН приводит к развитию митохондриальной дисфункции в головном мозге новорожденных. Так, нами было зарегистрировано в головном мозге крысят контрольной группы угнетение АТФазной активности и активности митохондриальной креатинфосфокиназы и малатдегидрогеназы, что свидетельствовало о нарушении основных функций митохондрий - продукция и транспорт энергии. Кроме того, было выявлено снижение уровня малата, изоцитрата и торможение активности СДГ, свидетельствовавшее о дискоординации в цикле Кребса. В мозге у крысят контрольной группы наблюдалась активация компенсаторного шунта Робертса, о чем свидетельствовали активация ГАМК-Т и ГДК и снижение уровня ГАМК и глутамата. Кроме этого, наблюдалась активация гликолиза (повышение уровня лактата). Однако активация компенсаторных энергетических реакций в условиях митохондриальной дисфункции не обеспечивает достаточного уровня энергии, о чем свидетельствовал низкий уровень АТФ в головном мозге новорожденных от матерей с ФПН.

Назначение животным с ФПН Тиоцетама во время беременности приводило к уменьшению явлений митохондриальной дисфункции в головном мозге новорожденных. Так, было выявлено увеличение продукции АТФ в окислительных реакциях цикла Кребса (увеличение уровня малата и изоцитрата), повышение активности СДГ и митохондриальной МДГ и м-КФК, общей АТФазной активности. Назначение Тиоцетама приводило к нормализации шунта Робертса, повышению уровня ГАМК и глутамата в головном мозге, что обеспечивало функциональное равновесие процессов возбуждения и торможения в головном мозге новорожденных и ограничивало возбуждение NMDA-рецепторов, снижая тем самым развитие глутаматной эксайтотоксичности. Кроме того, введение Тиоцетама в период беременности обеспечивало и уменьшение явлений лактат-ацидоза в головном мозге новорожденных, являющегося негативным прогностическим фактором при подобной патологии беременности. Введение во время беременности пирацетама не оказывало действия в отношении дисфункции митохондрий и энергодефицита. Кроме того, пирацетам не уменьшал явления лактат-ацидоза, что требует более жесткого контроля действия препарата при его использовании во время беременности.

В мозге новорожденных от матерей с ФПН наблюдалось развитие оксидативного стресса на фоне антиоксидантной недостаточности. Так, было зарегистрировано увеличение маркеров ОМБ - АФГ и КФГ, снижение активности СОД, ГПР и каталазы. По всей видимости, одной из причин активации оксидативного стресса в мозге новорожденных была гиперпродукция АФК в «паразитарных» биоэнергетических реакциях в условиях митохондриальной дисфункции, возникшей вследствие ФПН. Введение Тиоцетама во время беременности достоверно снижало концентрацию маркеров ОМБ и повышало активность таких ключевых ферментов антиоксидантной защиты, как СОД и каталаза, в головном мозге новорожденных. Модификация белковых молекул в условиях оксидативного стресса приводит к снижению функции белков в цепи переносчиков электронов, активности АТФазы, избирательности действия транспортных белков и ионных каналов и в конечном итоге к нарушению секреторной, инкреторной, транспортной функций нейрона и, как следствие, к развитию когнитивного дефицита. Поэтому антиоксидантный механизм нейропротективного действия Тиоцетама в условиях ФПН является весьма важным.

Нашими исследованиями было установлено, что ФПН приводила к активации NO-синтазы и гиперпродукции NO в мозге новорожденных крысят, о чем свидетельствовало повышение его стабильных метаболитов. Назначение экспериментальным животным Тиоцетама во время беременности приводило к нормализации этих показателей. Подобное действие также обеспечивает нейропротективный эффект Тиоцетама в отношении новорожденных от матерей с ФПН при назначении препарата в период беременности. Так как известно, что соотношение внутриклеточных концентраций NO и АФК зависит от характера действия этих соединений на активацию или депривацию процессов экспрессии генов и процессов транскрипции и трансляции в нейрональных клетках плода и обеспечение нормального развития когнитивно-мнестических функций ЦНС у потомства. В условиях митохондриальной дисфункции наблюдается активация NO-синтазы (особенно митохондриальной) и гиперпродукция оксида азота в тканях мозга, что способствует накоплению пероксинитрита (ONOO-), который подавляет экспрессию факторов транскрипции [6, 32].

Гистоиммунохимические исследования показали, что у новорожденных от матерей с ФПН число Fos-позитивных нейронов в СА1 зоне гиппокампа было достоверно ниже, чем у крыс интактной группы. Введение Тиоцетама в период беременности привело к достоверному повышению числа Fos-позитивных нейронов в СА1 зоне гиппокампа новорожденных по сравнению с контрольной группой животных. Также было установлено, что введение Тиоцетама нормализовало содержание антиапоптического белка Bcl-2 в нейронах гиппокампа. Считается, что Bcl-2 является металлосодержащим белком, «тушителем» свободных радикалов, тормозящим развитие апоптоза.

Морфометрическое изучение головного мозга новорожденных крысят от матерей с ФПН показало у них достоверное снижение плотности нейронов СА1 зоны гиппокампа. По сравнению со здоровыми новорожденными. При этом отмечалось уменьшение площади тел нейронов с понижением в них содержания РНК по сравнению со здоровыми новорожденными. ФПН существенно не влияла на плотность глиальных клеток в гиппокампе новорожденных, но вызывала достоверное увеличение площади глиоцитов с уменьшением в них содержания РНК. В гиппокампе новорожденных крысят от матерей с ФПН появлялись апоптические и деструктивно измененные нейроны. Назначение в период беременности животным с ФПН Тиоцетама оказывало нейропротективное действие, которое выражалось в увеличении плотности и площади нейронов и увеличении содержания РНК (повышение морфофункциональной активности нейронов). Нейропротективное действие Тиоцетама проявлялось и в отношении нейроглии за счет повышения, практически до уровня здоровых животных, плотности глиальных клеток и активации их морфофункциональной активности (увеличение РНК). Эти данные согласуются с результатами гистоиммунохимических исследований, в которых показано позитивное влияние Тиоцетама на транскрипционную активность нейронов гиппокампа новорожденных крысят. Введение Тиоцетама беременным крысам с ФПН обеспечивало достоверное снижение апоптических и деструктивно измененных нейронов гиппокампа у новорожденных крысят по сравнению с группой нелеченых животных. Введение по такой же схеме пирацетама не оказывало подобного достоверного нейропротективного эффекта.

Моделирование ФПН приводило к задержке физического и психического здоровья крысят, появлению у них неврологического дефицита легкой степени выраженности по шкале С.Р. McGrow. ФПН приводила к резкому увеличению ранней постнатальной смертности. Крысята, рожденные от матерей с ФПН, имели явные признаки когнитивно-мнестических нарушений, о чем свидетельствовало торможение ориентировочно-исследовательской активности (уменьшение количества горизонтальных, вертикальных движений, количества заглядываний в «норку», а также уменьшение латентного периода УРПИ). Назначение Тиоцетама во время беременности крысам с ФПН приводило к рождению более здорового потомства, которое по показателям покрытия шерстью, прорезывания зубов, открытия глаз не отличалось от интактных животных. Введение Тиоцетама достоверно снижало на 35 % раннюю постнатальную смертность потомства, рожденного от матерей с ФПН. Назначение Тиоцетама практически полностью устраняло проявление неврологического дефицита (двигательные расстройства, нарушение координации, а также тактильной и болевой чувствительности). Важным моментом в действии Тиоцетама было позитивное влияние на такие показатели когнитивно-мнестических функций ЦНС крысят, рожденных от матерей с ФПН, как сохранность памятного следа (увеличение латентного периода УРПИ) и активация ориентировочно-исследовательской активности животных (увеличение количества горизонтальных, вертикальных перемещений, количество заглядываний в «норку»). Применение пирацетама оказывало значительно меньший по силе терапевтический эффект. Указанный эффект Тиоцетама свидетельствует о его выраженном ноотропном действии и является экспериментальным обоснованием для клинического применения в педиатрической и акушерской практике для лечения ФПН и ее последствий.

Заключение

Проведенными доклиническими исследованиями на двух моделях ФПН была показана выраженная фетопротективная, нейропротективная и ноотропная активность препарата Тиоцетам при его парентеральном введении экспериментальным животным в дозе 250 мг/кг. Важным моментом в действии Тиоцетама было его непосредственное влияние на нарушения системы «мать - плацента-плод» в условиях ФПН. Назначение Тиоцетама приводило к уменьшению нарушений плацентарной гемодинамики (увеличение кровенаполнения плодных сосудов) и, особенно, к снижению нарушений энергетического обмена плаценты (увеличение уровня субстрата энергетического обмена - гликогена, повышение активности СДГ). Назначение Тиоцетама вызывало уменьшение явлений эндотелиальной дисфункции, роль которой в патогенезе ФПН несомненна, за счет повышения биодоступности оксида азота и влияния на тиодисульфидное равновесие миометрия. Тиоцетам значительно уменьшал негативное воздействие такого звена оксидативного стресса при ФПН, как окислительная модификация белка в плаценте и матке. Окислительная модификация белковых молекул при ФПН приводит к карбоксилированию, хлорированию, нитрованию, окислению функциональных групп (тиольных, фенильных, аминных) рецепторов, ионных каналов, активного центра ферментов и в конечном итоге к десенситизации (потере чувствительности) рецепторов, особенно эстрогеновых, окситоциновых и простагландиновых, повышению ионной проницаемости для кальция, появлению химически модифицированных (дегидрированных) гормонов с «извращенными» свойствами. Эти изменения не только влияют на степень тяжести протекающей ФПН, но усиливают перинатальное поражение ЦНС и негативно сказываются на физическом и психическом развитии потомства. Антиоксидантные свойства Тиоцетама, выявленные в этих исследованиях, не являются чем-то неожиданным, они подробно описаны при нейродеструктивных заболеваниях и представляют несомненное достоинство этого препарата при его назначении в условиях патологии беременности. Тиоцетам оказывал благоприятное влияние не только на систему «мать - плацента - плод» в условиях ФПН, но и на физическое и психическое развитие новорожденных, снижая раннюю неонатальную смертность. Известно, что более трети детей, рожденных от матерей с ФПН и отличающихся высокой частотой инфекционных, сердечно-сосудистых, психоневрологических заболеваний, в симптомокомплексе имеют признаки полисистемного нарушения клеточной энергетики. А одним из важнейших звеньев патогенеза считают митохондриальную дисфункцию. Известны и описаны наследственные (первичные) митохондриальные дисфункции, связанные с повреждением ядерного генома. Среди них различные формы младенческих миопатий, болезни Альперса, Лея, Барта, Менкеса, синдромы недостаточности карнитина, некоторых ферментов цикла Кребса и дыхательной цепи митохондрий. У новорожденных от матерей с ФПН более часто обнаруживаются признаки вторичной митохондриальной дисфункции. Именно в этих случаях показана энерготропная терапия, позволяющая добиться существенного клинического эффекта во всех сферах проявления патологического процесса. Тиоцетам является уникальным препаратом, сочетающим энерготропные и антиоксидантные свойства. Тиоцетам оказывал благоприятное энерготропное действие в головном мозге новорожденных, направленное на интенсификацию митохондриальной продукции и транспортировку энергии, на уменьшение лактат-ацидоза, на снижение нерационального использования нейротрансмиттерных аминокислот в компенсаторных шунтах синтеза АТФ. Тиоцетам нормализовывал морфофункциональные показатели нейронов гиппокампа новорожденных, уменьшая количество апоптических и деструктивно измененных клеток, повышал транскрипционную и трансляционную активность нейронов (содержание РНК и c-fos-экспрессии).

Результатом экспериментального лечения Тиоцетамом беременных с ФПН явилось снижение частоты неонатальной смертности, уменьшение выраженности проявлений когнитивного дефицита и неврологических расстройств у рожденного потомства.

Полученные данные являются экспериментальным обоснованием для клинического применения Тиоцетама в педиатрической и акушерской практике для лечения ФПН и ее последствий.

Литература
1. Абрамченко В.В. Клиническая перинатология. - СПб., 1996. - 240 с.
2. Агеева М.И. Допплерометрические исследования в акушерской практике. - М.: Видар, 2000. - 112 с.
3. Ариас Ф. Беременность и роды высокого риска. - М.: Медицина, 1989. - 656 с.
4. Афанасьев В.В. Цитофлавин в интенсивной терапии. - СПб., 2006. - 36 с.
5. Барашнев Ю.И. Перинатальная неврология. - М.: Триада-Х, 2001. - 638 с.
6. Белєнічев І.Ф., Левицький Е.Л., Губський Ю.І. Антиоксидантна система захисту організму // Совр. пробл. токсикол. - 2003. - № 2. - С. 32-38.
7. Бунин А.Т., Стрижаков А.Н., Медведев М.В Особенности мозгового кровообращения плода в норме и при синдроме задержки его развития // Вопр. охраны материнства - 1990. - № 2. - С. 43-47.
8. Бурдули Г.М. Репродуктивные потери (причины, факторы риска, пути профилактики: Автореф. дис…д-ра мед. наук. - М., 1998. - 47 с.
9. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения: Пер. с англ. - М.: Высшая школа, 1991. - 399 с.
10. Васильев И.Т. Клиническая эффективность мексидола. - М., 2005. - 16 с.
11. Зайнулина М.С. Роль дисфункции эндотелия в патогенезе плацентарной недостаточности // Регион. кровообр. и микроцирк. - 2007. - Т. 2. - С. 36-42.
12. Ильина Л.Н. Использование цитофлавина и перфторана при субкомпенсированной и декомпенсированной фетоплацентарной недостаточности: Автореф. дис... канд. мед. наук. - Иваново, 2007. - 15 с.
13. Качалина Т.С. Морфофункциональное обоснование целесообразности использования новых антигипоксантов в комплексной терапии фетоплацентарной недостаточности // Нижегородский мед. журн. - 2006. - № 7. - С. 81-89.
14. Каткова Н.Ю. Новый подход к лечению фетоплацентарной недостаточности // Ремедиум-Приволжье. - 2006. - Спецвыпуск «Охрана здоровья матери и ребенка». - С. 28-30.
15. Курцер М.А. Перинатальная смертность и пути ее снижения: Автореф. дис… д-ра мед. наук. - М., 2001. - 36 с.
16. Коколина В.Ф. Фетоплацентарная недостаточность. - М.: Медпрактика, 2006. - 224 с.
17. Мазур И.А., Чекман И.С., Беленичев И.Ф. Метаболитотропные препараты. - Запорожье, 2007. - 309 с.
18. Милованов А.П. Патология системы мать - плацента - плод: Руководство для врачей. - М.: Медицина, 1999. - 448 c.
19. Медведев М.В., Юдина Е.В. Задержка внутриутробного развития плода. - М., 1998. - 208 с.
20. Мусаев З.М., Наумчик Б.И., Буданцев А.В. Хроническая ПН: диагностика, лечение, акушерская тактика и особенности ведения неонатального периода // Актуальные вопросы акушерства и гинекологии. - М.; Сургут, 2000. - С. 99-102.
21. Радзинский В.Е., Смалько П.Я. Биохимия плацентарной недостаточности. - М.: Изд-во РУДН, 2001. - 273 с.
22. Радзинский В.Е., Милованов А.П. Экстраэмбриональные и околоплодные структуры при нормальной и осложненной беременности. - М.: Мед. информ. агентство, 2004. - 393 с.
23. Пирс Э. Гистохимия. - М., 1962. - 962 с.
24. Савельева Г.М. Пути снижения перинатальной заболеваемости и смертности // Вестн. Рос. ассоц. акуш. и гин. - 1998. - № 2. - C. 101-104.
25. Савельева Г.М., Федорова М.В., Клименко П.А., Сичинава Л.Г. Плацентарная недостаточность. - М.: Медицина, 1991. - 272 с.
26. Савченко И.Ю. Акушерская тактика при плацентарной недостаточности с нарушением плодово-плацентарного кровотока: Автореф. дис… канд. мед. наук. - М., 1992.
27. Сичинава Л.Г. Перинатальные гипоксические поражения центральной нервной системы плода и новорожденного: Автореф. дис… д-ра мед. наук. - М., 1993. - 38 с.
28. Стрижаков А.Н., Тимохина Т.Ф., Баев О.Р. Фетоплацентарная недостаточность: патогенез, диагностика и лечение // Вопр. гин., акуш. и перинатол. - 2003. - № 2. - С. 53-64.
29. Строк Р.И. Влияние хофитола на метаболические процессы и маточно-плодово-плацентарный кровоток у беременных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы // Вопр. гинекол., акушерства и педиатрии. - 2008. - Т. 7, № 2. - С. 68-71.
30. Современные методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / Под ред. М.И. Прохоровой. - Л.: Изд-во Ленинградского ун-та, 1982. - 272 с.
31. Томилов И.К. Энергетическое обеспечение головного мозга плода в условиях плацентарной недостаточности // Вестн. Ивановской мед. академии - 1998. - Т. 3, № 4. - С. 18-27.
32. Шилова Н.А. Прогностическое значение показателей оксида азота и молекул средней массы у новорожденных с постгипоксической кардиопатией и ее антенатальная профилактика с использованием препарата лимонтар: Автореф. дисс… канд. мед. наук. - Иваново, 2003. - 17 с.
33. Barker D.J.P. Fetal origins of coronary heart disease // BMJ. - 1995. - Vol. 311. - P. 171.
34. Doctor B.A., O'riordan M.A., Kirchner H.L. et al. Perinatal correlates and neonatal outcomes of small for gestational age infants born at term gestation // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2001. - Vol. 185. - P. 652.
35. Elimian A., Verma U., Canterino J., Shah J. Effectiveness of antenatal steroids in obstetric subgroups // Obstet. Gynecol. - 1999. - Vol. 93. - P. 174.
36. Fattal-Valevski A., Leitner Y., Kutai M. et al. Neurodevelopmental outcome in children with intrauterine growth retardation: a 3-year follow-up // J. Child Neurol. - 1999. - Vol. 14. - P. 724.
37. Fong K.W., Ohlsson A., Hannah M.E. Prediction of perinatal outcome in fetuses suspected to have intrauterine growth restriction: Doppler US study of fetal cerebral, renal and umbilical arteries // Radiology. - 1999. - Vol. 213. - P. 681.
38. Halliwell B. Molecular Biology of free Radicals in Human Diseases. - London: St. Lucia: OICA, 1999. - 410 p.
39. McGrow C.P. Experimental Cerebral Infarction Effects of Pentobarbital in Mongolian Gerbils // Arch. Neurol. - 1977. - Vol. 34, № 6. - Р . 334-336.
40. Packer L. Oxidative stress and Aging. - Oxford: Clarendon Press, 1995. - 426 p.
41. Turley K., Vlahakes G. The fetal lamb models // The Ann. о f Surgery. - 1998. - Vol. 105, № 12. - P. 422-446.
42. Jarvis S., Glinianaia S.V., Torrioli M.G. et al. Cerebral palsy andintrauterine growth in single births: European collaborative study // Lancet. - 2003. - Vol. 362. - P. 1106.
43. Kok J.H., den Ouden A.L., Verloove-Vanhorick S.P., Brand R. Outcome of very preterm small for gestational age infants: the first nine years of life //Br. J. Obstet. Gynaecol. - 1998. - Vol. 105. - P. 162.
44. Kolesnik Y.M., Orlovsky M.A. Image analysis system for quantitative immunofluorescence measurement // Microscopy and Analysis. - 2002. - № 5. - P. 12-16.
45. O'Keeffe M.J., O'Callaghan M., Williams G.M. et al. Learning, cognitive and attentional problems in adolescents born small for gestational age // Pediatrics. - 2003. - Vol. 112. - P. 301.
46. Skjaerven R., Gjessing H.K., Bakketeig L.S. New standards for birth weight by gestational age using family data // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2007. - Vol. 183. - P. 689.
47. Wieneroither H., Steiner H., Tomaselli J., Lobendanz M. Intrauterine blood flow and long-term intellectual, neurologic and social development // Ibid. - 2001. - Vol. 97. - P. 449.




Наиболее просматриваемые статьи: