Векторы в генотерапии рака: преимущество спор клостридий перед вирусами (продолжение...)

Лентивирусы относятся к ретровирусам и характеризуются более длительным инкубационным периодом. Терапевтическим преимуществом векторов на основе лентивирусов, по сравнению с ретровирусными векторами, является их способность переносить длинные фрагменты генетической информации в геном инфицируемой клетки. Эти вектора основаны преимущественно на вирусах иммунодефицита человека (ВИЧ) и быка, и обладают всеми уникальными характеристиками вирусного вектора MoMLV, а также способностью переносить гены в постмитотические клетки in vitro и in vivo (18). Несмотря на подтверждение эффективного переноса генов в раковые клетки на моделях солидных опухолей с помощью векторов на основе ВИЧ, терапевтическое использование этих векторов вызывает опасения, поскольку ВИЧ является серьезным патогеном человека. Однако в настоящее время проводятся клинические испытания лентивирусных векторов, направленные на оценку безопасности их применения в терапии СПИДа (19). Более безопасными считаются вектора на основе лентивирусов быка. Одним из примеров таких векторов служит безопасный для человека вирус болезни Йембрана JDV (Jembrana Disease Virus), поражающий определенные виды крупного рогатого скота в округе Йембрана на острове Бали в Индонезии (20, 21). Вирус JDV обладает теми же преимуществами в качестве вектора, что и ВИЧ: он способен интенсивно размножаться и интегрироваться в хромосомы не пролиферирующих клеток.

(Б) Аденовирусные векторы

Одной из наиболее хорошо изученных и широко используемых систем доставки терапевтических генов в раковые клетки человека являются вектора на основе аденовирусов (АВ, adenoviral vector - AV). Они особенно полезны в тех случаях, когда необходима лишь временная продукция терапевтического гена. Аденовирусы способны к воспроизводству в больших количествах и характеризуются эффективным переносом генов в различные типы раковых клеток (22). Два варианта векторов на основе аденовирусов были одобрены в Китае для клинического применения (23).

Кроме этого, несколько векторов на основе собачьих, свиных, овечьих, бычьих и птичьих аденовирусов было разработано для генотерапии раков человека. Один из таких векторов продемонстрировал терапевтическую эффективность на модели рака простаты у животных (24).

Основной проблемой, возникающей при разработке аденовирусных векторов для терапии рака, является недостаточная инфицирующая способность вирусов. В настоящее время проводятся интенсивные исследования, направленные на повышение прицельности и терапевтической эффективности рекомбинантных аденовирусных векторов (25).

(В) Векторы на основе адено-ассоциированных вирусов

Вектора на основе адено-ассоциированных вирусов (ААВ, аdeno-associated virus - AAV) не вызывают токсического эффекта и проявляют высокую инфицирующую способность, как показывают доклинические испытания нескольких таких вирусов (26). На моделях глиомы у грызунов было продемонстрировано, что ААВ, кодирующий рецептор фактора роста сосудого эндотелия VEGF (vascular endothelial growth factor), способен блокировать рост опухолей. Несмотря на высокую эффективность ААВ, технология их получения и очитки представляет собой достаточно сложный и дорогостоящий процесс (27).

(Г) Векторы на основе вирусов герпеса

Благодаря высокой эффективности и не сложной методике получения, векторы на основе вирусов герпеса пользуются особенной популярностью среди разработчиков векторных систем. В настоящее время со многими вариантами терапевтических векторов на основе вирусов герпеса проводятся клинические испытания. Как в случае векторов на основе других вирусов, терапевтический интерес представляют только репликационно-компетентные штаммы вирусов герпеса. Первый вектор такого рода был создан на основе мутантного вируса герпеса с дефектным геном r34.5, отвечающим за нейротоксичность вируса. Инактивация гена r34.5 ограничила способность вируса к размножению в клетках центральной нервной системы и блокировала возможность его существования в латентной форме. Однако позже обнаружилось, что отсутствие активности гена r34.5 значительно снизило способность мутантного вируса к воспроизводству в раковых клетках (28).

Терапевтические возможности векторов на основе вирусов герпеса могут существенно ограничиваться наличием к нему иммунитета у пациентов. Иммунный ответ организма предотвращает перенос вирусами терапевтических генов к периферическим органам и вызывает гепатотоксичность. Однако некоторые мутантные штаммы вирусов герпеса продемонстрировали успешное лечение рака печени в модели на мышах, обусловленное, как предполагают ученые, непосредственным вирусным онколизисом и активностью специфических эффекторных клеток иммунной системы (29).

(Д) Вирусные векторы направленного действия

Основной проблемой, связанной с генотерапией вирусными векторами, остается низкая эффективность адресной доставки генов в раковые клетки. На пути к клетке-мишени вирус сталкивается с физическим препятствием – эндотелиальной стенкой сосудов. В качестве одного из способов решения этой проблемы был разработан аденовирусный вектор, нацеленный на рецепторный механизм трансцитоза (прохождения сквозь клетки эндотелиалия) с помощью специальных адаптерных молекул (32). Подвергшиеся трансцитозу вирусные частицы сохраняли способность заражать клетки, но эффективность транспорта вирусов сквозь клетки оставалась низкой. В настоящее время разрабатываются аденовирусные вектора, содержащие как сигнальные молекулы, направляющие вирусы на трансцитоз, так и молекулы, опосредующие связывание и заражение раковых клеток, находящихся «по ту сторону» стенки сосудов (33).

(Е) Мультифункциональные частицы на основе вирусных векторов

Концепция мультифункциональных частиц (МФЧ) на основе вирусных векторов возникла относительно недавно. Она направлена на то, чтобы терапевтические вирусные векторы осуществляли сразу несколько функций: адресную доставку генетического материала именно в раковые клетки, давали возможность их визуализации в организме и обладали бы прогрессирующим онколитическим действием. В качестве примера МФЧ на основе вирусного вектора можно привести ААВ с модифицированными белковыми «шипами», находящимися на оболочке вируса (с помощью шипов вирус взаимодействует с клеткой-мишенью). Изменения позволили одновременно «нацеливать» вирусы на раковые клетки и визуализировать передвижение, воспроизведение и распространение ААВ. Взаимодействие тимидин-киназы ТК ВПГ, находящейся на поверхности модифицированного ААВ, с известным субстратом для позитронной эмиссионной томографии (Positron Emission Tomography, PET) 18F-пенцикловиром (18F-penciclovir) позволяет проводить мониторинг вирусных частиц в клинической практике. Кроме этого, фермент ТК ВПГ открывает возможности для так называемой суицидной генотерапии, суть которой заключается в следующем: фермент ТК преобразует свои субстраты (такие лекарства, как ганцикловир) в метаболиты, узнаваемые ферментами зараженной клетки. Последовательное воздействие клеточных белков на эти метаболиты приводит к образованию токсичного конечного продукта, вызывающего гибель клетки (34). Интересно, что продукция ТК ВПГ инфицированной опухолевой клеткой индуцирует самоуничтожение смежных клеток, в чем проявляется одно из свойств МФЧ – прогрессирующее онколитическое действие.

Концепция МФЧ на основе вирусных векторов открывает широкие возможности применения нанотехнологий. Мониторинг вирусных частиц можно осуществлять с помощью наноразмерных меток, иммобилизованных на оболочках вирусов (35). Однако вопрос об адресной доставке вирусных МФЧ в клетки опухоли остается открытым.

Механизмы генотерапии с помощью вирусных векторов

(А) Коррекционное добавление гена

Все онкологические заболевания принято подразделять на p53-зависимые и p53-независимые, поскольку большинство случаев заболевания раком опосредовано мутациями в гене p53. Белок р53 представляет собой известный опухолевый супрессор, основная функция которого заключается в поддержании стабильности генома. Он принимает участие в регуляции клеточного цикла, в исправлении возникающих дефектов ДНК и в апаптозе – запрограммированной клеточной гибели . Воздействие на клетку факторов, вызывающих изменения в структуре ДНК, таких как ультрафиолетовое излучение, ионизирующая радиация и различные химические вещества, приводит к активации белка p53, который индуцирует либо арест клеточного цикла, необходимый для исправления возникших дефектов ДНК (репарацию), либо запускает механизм апоптоза. По этой причине мутации в гене p53 могут приводить к неконтролируемой клеточной пролиферации и к мутагенезу, опосредуя возникновение и прогрессию злокачественного новообразования.

Доклинические испытания показали, что замена мутантного гена p53 в раковых клетках геном дикого типа (не содержащим мутаций) с помощью методов генотерапии, приводит к полному восстановлению функций белка p53 и запускает апоптоз злокачественных клеток(36,37).

Клинические испытания ретровирусных и аденовирусных векторов, несущих неповрежденные гены p53, оказались эффективными в замене дефектных генов p53 у пациентов, страдающих немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ, non small cell lung cancer - NSCLC) и бронхоальвеолярной карциномой (38,39,40). К сожалению, в клинических испытаниях не удалось обнаружить значительного терапевтического эффекта даже при совместном применении аденовирусных векторов, рекомбинантных по гену p53 дикого типа, и химиотерапии (41).

(Б) Суицидная генотерапия

Суть суицидной генотерапии заключается в доставке в злокачественные клетки гена, кодирующего фермент, который конвертирует пролекарство в лекарство - «суицидный токсин», вызывающий гибель зараженных раковых клеток. Ярким примером суицидного фермента является тимидинкиназа (ТК) вируса простого герпеса (ВПГ) (herpes simplex virus - HSV). ТК ВПГ преобразует нетоксичные аналоги нуклеозидов, такие как ганцикловир или ацикловир, в токсичные вещества, приводящие к гибели клеток. Наподобие описанной выше методики аденовирусного переноса гена p53, доклинические испытания аденовирусного вектора AdHSV TK (adenoviral HSV TK), кодирующего ТК ВПГ, продемонстрировали гибель не только инфицированных, но и смежных с ними клеток при систематическом введении ганцикловира. Эффект объясняется как воздействием токсинов, высвобождаемых зараженными клетками, на соседние клетки, так и ответом иммунной системы на инфекцию (42).






Наиболее просматриваемые статьи: