Векторы в генотерапии рака: преимущество спор клостридий перед вирусами (продолжение...)

Клинические испытания AdHSV TK, который вводили в плевральную полость больным мезотелиомой плевры, продемонстрировали успешный перенос тимидинкиназы у большей части пациентов, при этом у нескольких больных опухоли частично сократились (43).

Основной проблемой, препятствующей применению этой стратегии в клинической практике, является низкая эффективность доставки терапевтических генов.

(В) Иммуно-генотерапия

Еще один механизм генотерапии злокачественных новообразований основан на индукции иммунного ответа организма, направленного на разрушение опухолей. В отличие от коррекционной замены гена и суицидной генотерапии, иммунная генотерапия обладает теоретическим преимуществом, поскольку кроме временного воздействия на опухоль иммунной системы, возможен пролонгированный противоопухолевый эффект, связанный с иммунологической памятью. Такая методика особенно полезна для элиминации метастазов, обнаруживаемых в разных органах и системах организма.

Фаза I доклинических испытаний лечения НМРЛ аутологичными опухоль-инфильтрующими лимфоцитами (ОИЛ) (tumour infiltrating lymphocyte - TIL), модифицированными геном интерлейкина-2 (IL-2) с помощью аденовирусных векторов, выявила значительную регрессию опухолей у испытуемых. Интерлейкины обеспечивают передачу сигналов между клетками иммунной системы, а IL-2 усиливает активность ОИЛ. В ходе испытаний ОИЛ изолировали из злокачественного плеврального экссудата, взятого у больных НМРЛ, генетически модифицировали их с помощью аденовирусного вектора, несущего ген IL-2, и вводили пациентам измененные ОИЛ в плевральную полость, после чего обнаружили сокращение новообразований.

Другой подход, используемый в доклинических исследованиях, основан на генетическом модифицировании дендритных клеток с помощью гена, кодирующего интерлейкин-7 (IL-7). Белок IL-7 стимулирует цитотоксический иммунный ответ и снижает выработку опухолевыми клетками трансформирующего фактора роста TGF-beta (transforming growth factor), обладающего иммуносупрессивным действием. Введение внутрь опухолей дендритных клеток, модифицированных АВ AdIL-7, содержащим ген IL-7, привело к регрессии опухолей и формированию иммунной памяти у мышей, что демонстрирует значительные преимущества этой методики по сравнению с непосредственным введением в опухоли вирусных векторов AdIL-7. Аналогичный подход, основанный на генетической модификации дендритных клеток лентивирусной конструкцией продемонстрировал терапевтический эффект более, чем у 85% пациентов (46).

(Г) Генотерапия, направленная на подавление ангиогенеза

Злокачественные опухоли характеризуются усиленным ангиогенезом. Один из подходов генотерапии нацелен на подавление формирования кровеносных сосудов в раковых опухолях. Известно несколько ингибиторов ангиогенеза (например, ангиостатина (47) и эндостатина (48)), вызывающих регрессию опухолей посредством подавления образования кровеносных сосудов, как было продемонстрировано в моделях на животных. Опухолевый ангиогенез можно подавить также с помощью доставки в сосуды опухоли генов, продукты которых блокируют образование кровеносных сосудов.

Белок Raf необходим для ангиогенеза, поскольку мыши, нокаутные по гену, кодирующему Raf, погибали на ранних этапах развития из-за серьезных дефектов сосудов. Доставка мутантного гена Raf в опухоли мышей индуцировала апоптоз раковых эндотелиальных клеток и регрессию опухолей.

Эндотелиальные клетки растущих сосудов опухолей усиленно производят рецептор фактора роста эндотелия сосудов 2 (vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGF2, известный также как FLK-1). Белок VEGF2 (FLK-1) также может оказаться удачной мишенью генотерапии, направленной на подавление ангиогенеза (49).

(Д) Технология «молчащих» генов (сайленсинг генов)

Одна из новейших технологий в генотерапии рака направлена на сайленсинг (от англ. silence -молчание) генов, отвечающих за рост и деление раковых клеток. «Заглушить» гены можно, например, с помощью механизма РНК-интерференции, при котором связывание коротких двунитевых молекул РНК с регуляторной последовательностью гена-мишени вызывает остановку синтеза продукта этого гена. С помощью РНК-интерференции ученым удалось добиться сайленсинга гена, кодирующего рецептор эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor EGFR), что вызвало подавление роста клеток НМРЛ (50).

Споры клостридий специфически нацелены на раковые опухоли и доставляют в них терапевтические гены

Эффективная генотерапия рака станет возможной при получении такого вектора, который мог бы онколитически воздействовать как на саму опухоль, так и на ее метастазы, находящиеся в разных тканях организма. Этим требованиям удовлетворяют споры клостридий. Клостридии – строго анаэробные грамположительные бактерии, имеющие палочковидную форму, способные образовывать споры при неблагоприятных условиях. К настоящему времени насчитывается до 80 видов клостридий. Для роста всех видов клостридий необходимы анаэробные условия, но устойчивость этих бактерий к концентрации кислорода в среде варьирует от вида к виду. Внутривенное введение спор клостридий продемонстрировало значительное преимущество этого метода в лечении рака перед известными методами, поскольку споры клостридий достаточно легко получать и хранить. Прорастание спор происходит только в том случае, если они попадают в анаэробные условия. О способности клостридий к спонтанной колонизации опухолей у онкологических больных и об очевидной их нацеленности на опухоли было известно еще 50 лет назад. Первый эксперимент, проведенный в 1947 году, показал, что введение спор C. Histolyticum в саркому мыши вызвало онколизис и регерессию опухоли (51). Внутривенное введение мышам спор штамма C. tetani , вызывающего столбняк, привело в течение 48 часов к гибели мышей, имевших раковые опухоли, из-за колонизации опухолей бактериями C. tetani и развившегося столбняка. А введение спор C. tetani мышам, не имеющих злокачественных опухолей, никак не сказалось на их здоровье. Этот эксперимент доказал, что в анаэробных условиях, характерных для солидных опухолей, C. tetani способны селективно прорастать из спор и интенсивно размножаться, систематически выделяя токсины (52). Очевидно, что для лечения заболеваний человека нельзя использовать патогенные виды бактерий. Одним из первых непатогенных штаммов клостридий стал C. butyricum M-55, который впоследствии назвали C. oncolyticum, а затем – C. sporogene (ATCC13732). Этот штамм клостридий обладает онколитическим действием.

Внутривенное введение спор некоторых штаммов сахаролитических клостридий (сбраживающих преимущественно полисахариды или сахара) грызунам, имеющим раковые опухоли, вызывало колонизацию бактериями только обедненных кислородом участков опухолей, что приводило только к частичному онколизису (54, 55).

Первым генетически модифицированным штаммом клостридий стал C. sporogenes , в который ввели ген, кодирующий естественный антибиотик колицин E3 (Colicin E3) в E. Coli. Было показано, что колицин E3 обладает некоторым противораковым действием (56).

Следующий рекомбинантный штамм клостридий – C. sporogenes NCIMB10696 содержащит ген деаминазы цитозина CD (cytosine deaminase) из E. coli. Этот штамм клостридий эффективно колонизировал опухоли, но индуцировал только временный онколитический эффект по неизвестным причинам (57). Внутривенное введение спор различных штаммов клостридий вызывало колонизацию опухолей, оцениваемую в 108 КОЕ/г опухоли (колониеобразующих единиц -colony formation unit, CFU).

Сахаролитические клостридии, включая штаммы C. beijerinckii ATCC17778, C. acetobutylicum DSM792 (ATCC824) или C. acetobutylicum NI4082 (реклассифицированный как C. saccharoperbutylacetonicum) и C. butyricum, не патогенны. Разработка этих штаммов для нужд генотерапии была профинансирована биотехнологическими компаниями. В эти штаммы вводили терапевтические гены, кодирующие TNF-alpha, CD и NTR, оценивали уровень продукции клостридиями рекомбинантных белков и анализировали противораковый эффект модифицированных спор (58,59). Однако тестирование C. acetobutylicum, модифицированного CD, на моделях солидных опухолей у животных не выявило значительного онколитического действия. Предположительно, низкая эффективность рекомбинантного штамма связана с недостаточной колонизацией опухолей клостридиями (60). Вектора на основе «суперколонизаторов» опухолей – штаммов клостридий C. sporogenes и C. novyi-NT, рекомбинантных по NTR, продемонстрировали значительный противоопухолевый эффект при их совместном использовании с пролекарством CB1954 (61) (см. таблицу). Этот эксперимент свидетельствует о значительном клиническом потенциале векторов на основе спор клостридий.

Преимущества векторов на основе спор клостридий для генотерапии рака

В настоящее время разрабатываются различные векторные системы для генотерапии рака. Однако ни один из имеющихся на сегодняшний день векторов не является в достаточной степени эффективным в терапии рака, что связано, преимущественно, со сложным патогенезом солидных опухолей. Вектора на основе спор клостридий вызвали повторную волну интереса по приведенным ниже причинам.

Безопасность

Вирусные вектора далеко не безопасны для человека, поскольку:(1) они могут продуцировать токсичные вирусные белки и вызывать сильный иммунный ответ (62);(2) уменьшение иммунногенности трансгена приводит к снижению эффективности терапии (63);(3) вирусные частицы могут поражать не только опухоли, но и здоровые ткани.Векторы на основе спор клостридий представляются более безопасными, чем вирусные системы. Клостридии строго анаэробны и не способны существовать вне опухолей. Эксперименты с C. novyi-NT показали, что эти бактерии не заселяли ткани в области искусственно смоделированного инфаркта сердца, видимо из-за того, что уровень гипоксии в этих тканях был ниже, чем в тканях солидных опухолей. Даже в случае побочных эффектов, от клостридий легко избавиться с помощью антибиотиков. Например, применение метронидазола позволяет полностью уничтожить споры клостридий в крови больных за 9 дней (64).






Наиболее просматриваемые статьи: