Способ получения тромбоцитов. Изобретение

В.А. Лифановский
Патент РФ 2068265

Введение

Способ получения тромбоцитов относится к гематологии. Цель изобретения - экономия крови и повышение степени очистки тромбоцитов. Тромбоциты культивируются в синтетической питательной среде. Способ включает операции: выделение тромбоцитов из крови дифференциальным центрифугированием, приготовление жидкой и твердой питательной сред, посев тромбоцитов в жидкую питательную среду, посев на твердую питательную среду, посев на жидкую питательную среду, выделение тромбоцитов из среды и их промывка солевыми растворами. Культивирование производится при температуре 0 - 44°С в течение 1 - 45 суток при аэрации. Полученные тромбоциты и среда после культивирования в ней тромбоцитов могут быть использованы как сырье при производстве лекарственных препаратов.

Изобретение относится к медицине, точнее к гематологии и вопросу получения клеток крови и их заменителей.

Известен способ получения тромбоцитов, включающий последовательное центрифугирование индивидуальных доз крови с последующей отмывкой. При первом мягком центрифугировании крови осаждаются эритроциты и лейкоциты. При втором, более жестком центрифугировании осаждаются тромбоциты. Полученные тромбоциты отмываются различными солевыми средами (О.К.Гаврилов, Г.И.Козинец, Н.Б.Черняк "Клетки костного мозга и периферической крови" //М., "Медицина",1985 г., с.227 - 231).

Недостатком указанного способа получения тромбоцитов является то, что для его осуществления, для получения нужного количества тромбоцитов, требуется большое количество крови, которое может быть взято у нескольких доноров, которые должны быть подобраны по антигенам АВО и HLA, что сделать очень сложно (Хью Р.К. Барбер "Иммунобиология для практических врачей"//М., "Медицина", 1980г., с. 137-138). Очистка не обеспечивает освобождение тромбоцитов от примеси эритроцитов и лейкоцитов полностью, а также от веществ, преимущественно белковой природы, определенных плазмой крови, которые обволакивают тромбоциты толстым слоем снаружи (З.С.Баркаган "Геморрагические заболевания и синдромы"//М., "Медицина", 1989 г., с. 14-15).

Целью настоящего изобретения является устранение указанных недостатков, т.е. создание способа получения тромбоцитов, полностью свободных от факторов, определенных плазмой крови и других форменных элементов ее, имеющих наперед заданные характеристики, и экономия крови.

Метод

Указанная цель достигается тем, что тромбоциты, полученные из малого количества крови путем дифференциального центрифугирования, помещают в среду, содержащую определенный набор химических веществ, и выдерживают в ней при определенных физических и химических условиях, при соблюдении условий строгой стерильности, т.е. дополнительно производится культивирование тромбоцитов в питательной среде, что и определяет возможность их получения в большом количестве, при минимальной затрате крови. Полученные таким способом тромбоциты не несут на своей мембране факторы, определяемые кровью донора. Выделение тромбоцитов из среды производится фильтрованием или центрифугированием с одновременной отмывкой солевыми средами. Среда, применяемая культивирования тромбоцитов, имеет следующие компоненты в мг/л:

Хлористый кальций

3 - 200

Хлористый калий

5 - 10000

Хлористый цинк

0,01 - 100

Натрий фосфорнокислый двухзамещенный

5 - 10000

Сульфат магния

0,01 - 100

Гексацианоферрат /11/ калия

0,01 - 200

DL лейцин

3 - 2000

DL серин

1,9 - 1500

DL триптофан

0 - 500

L цистеин

0 - 400

L гистидин

1,7 - 1500

L аргинин

0,6 - 500

L глютаминовая кислота

1,1 - 1000

DL метионин

0,5 - 500

L пролин

0,8 - 1000

L аспарагин

0,9 - 1000

DL лизин

0 - 700

L глютамин

0 - 500

Аминоуксусная кислота

0,3 - 500

Сахароза

100 -10000

Аденозинтрифосфат

0 - 2000

Фолиевая кислота

0,01 - 0,5

Тиамина бромид

0,01 - 1

Пангамат кальция

0,01 - 0,5

Пиридоксина гидрохлорид

0,01 - 0,5

Цианокобаламин

0,01 - 0,5

Аскорбиновая кислота

0,01 - 1

Вода дистиллированная

один литр

Сахаразу можно заменить инозитом, дульцитом или маннитом, взяв их в том же количестве.

Культивирование

Культивирование тромбоцитов возможно при условии восполнения потребляемого ими кислорода. Поэтому культивирование можно проводить в тонком слое при доступе к поверхности свежего воздуха, или применив продувание питательной среды воздухом мелкими пузырями, что дополнительно предотвращает агрегацию тромбоцитов.

Добавив в среду агар-агар, можно получить твердую питательную среду, при этом можно не вводить углеводы, т.к. тромбоциты разжижают агар-агар.

Культивирование можно производить в стеклянной посуде, но нужно учесть, что примеси в стекле влияют на интенсивность роста, поэтому желательно использовать кварцевое стекло. Форма посуды может быть любой.

Культивирование производится в термостате при температуре 0 - 44°С в течение 1- 50 суток.

Первый этап развития культуры тромбоцитов, выделенных из крови, занимает длительное время, для его сокращения нужен редкий посев и отмывание тромбоцитов, например, 0,9% раствором хлористого натрия, перед посевом. Культура после последующих пересевов развивается быстрее. Срок развития может служить индикатором чистоты культуры.

Применяя известные методы пересева с жидкой питательной среды на твердую и обратно, можно добиться желаемой однородности и очистки тромбоцитов.

Экономию крови можно считать полной, т.к. она используется только для первоначального посева.

Конечным продуктом являются тромбоциты, образовавшиеся в результате некоторого деления исходных тромбоцитов, полученных из крови, при их росте и размножении на искусственной питательной среде. Поэтому способ дает возможность получить нужное количество тромбоцитов, свободных от плазмы крови и антигенов, определяемых ею.

Пример исполнения

Способ включает приготовление питательной среды, взятие крови, выделение и отмывку тромбоцитов, поспев, культивирование, выделение из среды культивирования и промывку.






Наиболее просматриваемые статьи: