Рост и размножение бактерий (продолжение...)

Принципы культивирования и идентификации бактерий

Микроорганизмы (за исключением облигатных внутриклеточных паразитов - риккетсий, хламидий, вирусов и простейших) культивируют, как правило, на искусственных питательных средах. В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида питательные среды должны содержать соответствующие исходные вещества, необходимые для пластического и энергетического метаболизма. Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, в научно-исследовательской работе и в микробиологическом производстве вакцин, антибиотиков и других биологически активных продуктов микробной жизнедеятельности.

Условия культивирования также зависят от свойств соответствующих микроорганизмов. Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37°С в течение 1-2 сут. Однако некоторые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии коклюша - в 2-3 сутках, а микобактерий туберкулеза - в 3-4 неделях.

Для стимуляции процессов роста и размножения аэробных микробов, а также сокращения сроков их выращивания используют метод глубинного культивирования, который заключается в непрерывном аэрировании и перемешивании питательной среды. Глубинный метод нашел широкое применение в биотехнологии.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его инертными газами в герметизированных термостатах - анаэростатах. Анаэробов выращивают на питательных средах, содержащих редуцирующие вещества (глюкозу, муравьинокислый натрий и др.), уменьшающие окислительно-восстановительные потенциал.

В диагностической практике особое значение имеют чистые культуры бактерий, которые выделяются из исследуемого материала, взятого у больного или объектов окружающей среды. С этой целью используют искусственные питательные среды, которые подразделяют на основные, дифференциально-диагностические и элективные самого разнообразного состава. Выбор питательной среды для выделения чистой культуры имеет существенное значение при бактериологической диагностике. В большинстве случаев используют твердые питательные среды, предварительно разлитые в чашки Петри. На поверхность среды петлей помещают исследуемый материал и растирают шпателем, чтобы получить изолированные колонии, выросшие из одной клетки. Пересев изолированной колонии на скошенную агаровую среду в пробирку приводит к получению чистой культуры.

Для идентификации, т.е. определения родовой и видовой принадлежности выделенной культуры, чаще всего изучают фенотипичес-кие признаки:

  • морфологию бактериальных клеток в окрашенных мазках, либо нативных препаратах;
  • биохимические признаки культуры по ее способности фермен тировать углеводы (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, маннит и др.), образовывать индол, аммиак и сероводород, являющиеся продуктами протеолитической активности бактерий.

Для более полного анализа применяют газово-жидкостную хромографию и другие методы. Наряду с бактериологическими методами для идентификации чистых культур широко используют иммунологические методы исследования, которые направлены на изучение антигенной структуры выделенной культуры. С этой целью используют серологические реакции: агглютанации, преципитации иммунофлюоресценции, связывания комплемента, иммуноферментный, радиоиммунный методы и др.

В настоящее время все более широкое применение в медицинской микробиологии находят генотипические методы, основанные на определении гомологии ДНК искомого микроорганизма в исследуемом материале, с эталонной ДНК. С этой целью используют полиме-разную цепную реакцию (ПЦР) и генетические зонды, сэндвичгибридизацию. Для постановки ПЦР ДНК-праймер - короткую однонитевую последовательность нуклеотидов, комплементарную начальному и конечному участку ДНК, - в избытке добавляют к нуклеиновой кислоте выделенной из исследуемого материала. После этого проводят гибридизацию. При наличии искомого гена происходит его гибридизация с праймером. После добавления ДНК-полимеразы и нуклеотидов начинается достраивание ДНК. Весь цикл многократно повторяется, в результате чего происходит амплификация генов, которые легко обнаруживаются. ПЦР в настоящее время широко применяется для диагностики большинства бактериальных и вирусных инфекций. Наряду с ПЦР для генетической идентификации применяют нуклеиновые зонды.

Зонд представляет собой плазмидную ДНК с интегрированным в нее фрагментом ДНК, меченным контрастным веществом или радиоактивной меткой. Меченый зонд вместе с исследуемым материалом наносится на мембранный фильтр, после чего определяется степень его гомологии и исследуемой ДНК. Данный метод дает возможность быстро определить в исследуемом материале ДНК тех или других микроорганизмов и поставить диагноз заболевания.







Также в разделе: Физиология и биохимия микроорганизмов (бактерий):
  » Светящиеся и ароматообразующие микроорганизмы
  » Пигметы
  » Метаболизм
  » Микробные сообщества