Получение моноклональных антител (гибридомная технология)

Для использования большинства иммунологических и серо-логических методов исследования необходимо иметь стандартные преврати антител. Основные требования к этим препаратам - специфичность, стабильность, достаточное содержание антител. Сложность получения таких препаратов путем иммунизации животных связана с гетерогенностью получаемых при этом антител. Каждый природный антиген многокомпонентен, и к каждому его эпитопу формируются отдельные клоны антителообразующих клеток, что обуславливает большое разнообразие продуцируемых антител. Более того, к одной антигенной детерминанте может образоваться множество вариантов молекул антител. Таким образом, антитела, получаемые от разных особей одного вида, иммунизированных одним антигенным препаратом, не полностью идентичны.

Получить абсолютно однородные антитела можно, только используя клетки - антителопродуценты одного клона - потомков одной специализированной клетки. Решить задачу, используя специально отобранные лимфоциты иммунного человека или животного, невозможно, поскольку срок жизни каждого клона клеток ограничен и количество продуцируемых антител очень невелико.

Положение коренным образом изменилось после того, как Г. Кёлер и Ц. Милштейн осуществили гибридизацию антителообразующих клеток, полученных от животного, с культивируемыми в пробирке клетками злокачественной опухоли - В-клеточной плазмацитомы. Полученные при этом гибридные клетки обладали свойствами обеих родительских клеток: способностью продуцировать антитела и способностью к неограниченному размножению вне организма.

Таким образом, были получены теоретически «бессмертные» клоны гибридных клеток (гибридомы), способные к образованию неограниченного количества однородных продуктов одного клона клеток - моноклональных антител.

Процедура получения гибридомных клеток и моноклональных антител сводится к следующему. Животное (чаще мышь) иммунизируют нужным антигенным материалом. После того как началась продукция антител, удаляют селезенку, и из нее извлекают клетки, среди которых имеются антителообразующие В-лимфоциты. Все клетки смешивают со специально отобранными клетками культуры В-миеломы, дефектными по ферменту метаболизирующему гипок-сантин. К смеси клеток добавляют вещество, повреждающее оболочки клеток и способствующее их слиянию между собой (полиэтилен-гликоль, лизолецитин или вирус Сендай). В результате образуются разнообразные гибридные клетки, а часть клеток остается негибридизированной. Для того чтобы выделить только гибридные клетки, полученную смесь культивируют на специальной среде ГАТ (содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин), в которой не могут жить родительские клетки. В среде остаются живыми только гибридные клетки, но с разными свойствами, так как в селезенке иммунизированного животного наряду с антителообразующими клетками, которые было необходимо получить, содержится много других лимфоцитов. Поэтому следующим этапом является отбор гибридных клеток, способных продуцировать необходимые антитела. Для этого взвесь полученных клеток разбавляют питательной средой и помещают в лунки специальных панелей так, чтобы в каждую лунку попало по одной клетке. Через определенное время определяют антитела, образовавшиеся в каждой лунке, и находят те клетки, которые можно использовать как родоначальников клона гибридомных клеток.

Отобранные гибридомные клетки можно культивировать in vitro или in vivo, получая необходимые количества клеток и моноклональных антител. Гибридомные клетки могут храниться в замороженном состоянии, пересылаться из лаборатории в лабораторию. В ходе приготовления гибридомных клеток может быть выделено несколько клонов клеток, продуцирующих антитела к разным эпитопам антигена, что позволяет провести его разносторонний анализ.

Моноклональные антитела могут использоваться для разных практических целей:

  • для идентификации клеток - выявления Т- и В-лимфоцитов и других клеток, определения их свойств;
  • для осуществления современных радиоиммунных, иммуноферментных и иммунолюминесцентных методов выявления антигенов и антител;
  • для определения локализации антигенов в организме и доставки к ним (например, в опухоль) лекарственных веществ, присоединенных к антителам;
  • для приготовления иммуносорбентов, позволяющих выделить ели удалить из организма антигены или клетки данной специфичности.





Также в разделе: Клиническая иммунология:
  » Вакцины
  » Иммунные сыворотки и иммуноглобулины
  » Серологические реакции
  » Оценка иммунного статуса